Serotipizacija Salmonella

Sample Control mikrobiološki laboratorij je akreditirao metodu HRI CEN ISO/TR 6579-3:2014 smjernice za serotipizaciju Salmonella spp. Referentna metoda serotipizacije s antiserumima predstavlja nastavak na horizontalnu metodu dokazivanja prisutnosti Salmonella spp., stoga i uvelike ovisi o prethodno dobroj pripremi, homogenizaciji uzoraka te postupcima obogaćivanja i izolacije na hranjive podloge. U biokemijski potvrđenim uzorcima provodi se postupak serotipizacije neovisno o uzorku iz kojeg je izolirana. Sukladno Uredbi Komisije (EZ) br. 2073/2005 o mikrobiološkim kriterijima za hranu propisano je da se svježe meso peradi dobiveno od rasplodnih jata vrste Gallus gallus, konzumnih nesilica, tovnih pilića te jata rasplodnih i tovnih pura te trupovi peradi, tovnih pilića i pura u kojima je detektirana Salmonella spp. moraju serotipizirati kako bi se utvrdila odsutnost Salmonella serovar Enteritidis i Salmonella serovar Typhimurium. Bitno je da se postupak provodi samo u adekvatno opremljenim laboratorijima, pod stručnim nadzorom uz poštivanje svih mjera opreza, praćenje uputa proizvođača prilikom rukovanja s antiserumima i adekvatnom zbrinjavanju inkubiranih materijala.

Prema shemi koju su razvili Kaufmann i White određuje se prisutnost ili odsutnost specifičnih O-antigena, H-antigena i Vi-antigena u izolatu. Danas je poznato više od 2600 različitih serovarova.

Antigenska formula pet najvažnijih serovara Salmonella povezanih s javnim zdravstvom

Antigeni koji se pojavljuju samo ako je kultura lizogenirana konvertirajućim fagom uvijek su podcrtani, dok neki antigeni mogu biti prisutni ili odsutni, neovisno o fagu i pišu se u uglatim zagradama.

O-antigen (somatski antigen)

Sastoji se od komponenata stanične stijenke bakterija, a sadržava molekule lipopolisaharida koji su endotoksini gram-negativnih bakterija. Sastoji se od lipida A i polisaharida. Sva toksičnost povezana je uz lipid A, a polisaharid je somatski ili O-antigen. Reakcija O-antigena s antiserumima rezultira zrnatom aglutinacijom. Na temelju somatskog antigena koje posjeduju, svrstavaju se u serološke skupine, koje se označavaju slovima počevši sa skupinom A, a koja uključuju antigen O:2, sve do skupine Z koja sadrži antigen O:50. Kako je O-antigena više nego slova abecede, preostale antigene skupine označene su brojevima svojih O-antigena, od O:51 do O:67. U današnje vrijeme poželjno je označiti brojem O-antigena karakterističnim za skupinu. Slova su zadržana i prikazana su u zagradama, npr. O:4 (B).

H-antigen (flagelarni antigen)

Bič ili flagele bakterija sadrže flagelarni antigen, a glavna komponenta su proteini. Može se lako razgraditi alkoholom, kiselinom i temperaturom iznad 60°C. Reakcija H-antigena s antiserumima rezultira pahuljastom aglutinacijom (nježnijom od zrnate). Mnoge posjeduju dvije faze H-antigena, ali također su poznate monofazne i trofazne varijante. Prva faza naziva se specifična faza, a druga je nespecifična faza. Prva faza označena je malim slovom od a do z. Budući da je otkriveno mnogo novih H-antigena oni uz slovo z nose i brojčanu oznaku, primjerice z1, z2, z3 ... z91.

Vi-antigen (kapsularni antigen)

Kapsularni (površinski) antigen može prekriti O-antigene tako da bakterije ne aglutiniraju s O-antiserumima. Glavna komponenta Vi-antigena je polisaharid. Sojevi koji posjeduju Vi-antigen virulentniji su od sojeva bez Vi-antigena. Vi-antigen može biti prisutan u samo tri serovara Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin.

Postupak serotipizacije

Bakterijska kultura mora biti čista, biokemijski potvrđena i precijepljena na neselektivnu hranjivu podlogu. Svaki dobavljač antiseruma proizvodi vlastite komplete antiseruma sa svojim jedinstvenim uputama za uporabu, stoga je važno slijediti upute dobavljača za postizanje optimalnih rezultata. Prije početka aglutinacije na predmetnici s antiserumima treba provjeriti da izolat kojeg treba serotipizirati spontano aglutinira. Kapne se jedna kap odgovarajućeg antiseruma na čistu predmetnicu, kultura s agara nanese se ezom izravno u kap antiseruma na predmetnici i lagano miješa dok suspenzija ne postane homogena. Laganim pokretima predmetnice suspenzija se miješa najviše minutu, a aglutinacija se pretražuje golim okom ili lupom (na tamnoj pozadini).

Aglutinacija s O-antigenima

Postupak obično započinje s odgovarajućim antiserumima koji sadržavaju specifična protutijela za više somatskih antigena. Postoje antiserumi koji sadržavaju protutijela za 4 do 7 somatskih antigena, primjerice polivalentni antiserum za O-antigene A, B, D, E i L zatim za C, F, G, H O-antigene itd. Polivalentni antiserumi služe da se s manje postupaka aglutinacije odredi kojoj serološkoj skupini pripada izolat koji se tipizira. Kada se odredi s kojim polivalentnim antiserumom aglutinira izolat, postupak se nastavlja aglutinacijom s monovalentnim antiserumima. Primjerice, ako je izolat aglutinirao s polivalentnim antiserumom za serološke skupine C, F, G i H, postupak se nastavlja monovalentnim antiserumima za četiri navedene skupine.

Aglutinacija s H-antigenima

Kada se odredi kojoj serološkoj skupini pripada izdvojeni soj, prelazi se na aglutinaciju s H-antiserumima da bi se utvrdio točan serovar Salmonella spp. Velik broj serovarova Salmonella je dvofazan, što znači da mu flagele imaju dvije faze: fazu 1 (specifičnu) i fazu 2 (nespecifičnu). Uzgojena kultura Salmonella može imati obje ili samo jednu od faza. Ako se kod serovara s dvije faze dobije pozitivna reakcija s jednom fazom, a drugom ne, mora se upotrijebiti postupak fazne inverzije. U polumeki Sven gard agar koji dopušta puzanje Salmonella po površini dodaje se antiserum one faze koja je uspješno aglutinirana. Time se razvoj te faze blokira, a izolat koji se ispituje može puzati samo ako razvije drugu fazu flagela. U malu Petrijevu zdjelicu ulije se 1-2 kapi antiseruma za fazu flagela koja je uspješno aglutinirana, npr. ako je kod Salmonella Typhimurium uspješno aglutiniran izolat s H:i antiserumom, onda se taj antiserum ukapa u Petrijevu zdjelicu. Na ukapani antiserum doda se Sven Gardov agar (ohlađen na 47°C), lagano se pomiješaju agar i antiserum u Petrijevoj zdjelici i ostave da se stvrdnu. Nakon toga se u sredini Petrijeve zdjelice nacijepi pretraživana kultura i inkubira 24±3 sata. Bitno je da sutradan izolat od sredine gdje je nacijepljen propuzi površinom agara u Petrijevoj zdjelici. Potom se dio koji je propuzao uzme ezom i aglutinira određenim antiserumom (u slučaju S.Typhimurium s H:1,2 antiserumom koji je druga faza).

Trebate li ovu uslugu? Za više informacija o Serotipizaciji Salmonella ili o ovoj usluzi slobodno nas kontaktirajte.